第三代测序为什么这么贵?

PacBio三代测序最大的死穴是：通量不足。

如果通量不是限制因素，那么PacBio是目前最准确的测序方式：错误率可以无限接近罕见突变的发生率（即无法分辨是测序错误还是罕见突变）。

因为三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错，而如果系统错误，这是不可纠正的。

一图展现区别：

以下这幅图的数据来源：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3443046/figure/F2/
那么为何三代通量不足？技术瓶颈了，这要从三代测序原理说起。

PacBio三代测序基本单位叫做SMRT Cell，它是这样的：实际有效面积，接近成人的大拇指指甲，在这个面积上，均匀分布着15万个小孔。

测序时，当有一个DNA分子落入一个小孔内（0或多个DNA分子，则为无效孔），该小孔能生成有效数据（这里有一个有效小孔比率，Loading率，一般是1/3左右，即5W个小孔）。测序时，每合成（延伸）一个DNA残基时，会释放带荧光标记的磷酸残基。那么连续记录这数万个小孔的荧光信号，再通过机器学习算法，即可将波信号转化成碱基序列，甚至可以获得碱基修饰信息(碱基修饰会改变波的动力学特征)。这个过程里，对聚合酶有特殊要求：

1. 速度慢

2.延伸性好

3.准确性高。

那么三代技术瓶颈，到底在哪里？
简单讲，SMRT Cell的密度不是技术瓶颈，而是激光光路和感光元件。目前做到的地步是，精确分出15万束激光，射进每个小孔，感光元件可以精确记录每个小孔每次合成时，单个磷酸残基上荧光信号。

目前提高三代的通量，有以下几个途径：

1.升级硬件。这个是最直接有效的，直接提升那几个硬件短板的规格。但是，这也是最不可能的。因为升级任何一个短板硬件，都需要整个测序仪的硬件、耗材回炉。以目前PacBio的财报来看，还未实现盈利。与Illumina相反，PacBio在硬件上的利润非常微薄。据业内人士估计，Illumina成本每台估计大约在6～10万美元(零售价直接加0)，PacBio的售价略高于Illumina，但成本高好几倍，那个激光光路和感光元件放那里。。。。

2.提高Loading率。这个主要难度在建库和上样的优化上。

3.提高聚合酶延伸性并保持准确率。这个是目前PacBio（其实背后是某重组酶巨头）主要努力方向。以每Cell 5W条序列记，那么如果平均达到10kb读长，则产出为 5 x 10^8，也就是500M数据。提高到15kb则有750M。

目前在P6C4试剂下，大约每SMRT Cell平均可以做到 600M～1G数据量，个别用户达到2G（这个是DNA抽提和建库优化相当好了）。

下面有评论指出我误导rare/novel variants这块信息，OK，这里给足信息，2012年2月ABGT(PacBio产品2011年推出)，有Broad Institute研究院（学界生信第一牛的单位，当然我是这么认为的）的教授开了个讲座：

然后开始详细介绍：
1. 二代如何如何先天不足
2. PacBio的特点

3. PacBio碱基质量与读长无关（PS 这点许多人也认识错误)
4. 在难检出的位点上的性能比较：

5. 这里开始提PacBio主要缺陷了：Reference Bias
7. 那么Reference Bias如何造成的? 当时的Aligner没有针对PacBio的长读长进行特殊优化。
8. 做以上数据时，Broad Institute用的是他们自家的BWA
9 . 我们今天可以知道，真正适合PacBio的Aligner当时并没有被使用 (请参考答案：请问现在三代测序的reads用什么比对？ - Tang Boyun 的回答) ，

最后结论，在2012年，PacBio刚上市之初，生信Pipeline还没完善之时，随便提起一把破柴刀，就把Illumina砍了，这真是个悲伤的故事。上面讲了2012年Broad Institute开始给PacBio背书，那么最新进展(2014、2015)有些啥呢？以下大部分资料摘自2015 ABGT：

二代测序在做外显子组测序时，有一个非常巨大的缺陷，Reads分布不均一，特别在转录起始位点与转录终止位点的具体坐标上，往往有很大偏差。目前比较火热的lncRNA研究，你用二代做的话，很可能得不到精确的转录起始坐标（所以可能的话做下RACE），即你甚至无法好好研究是那个转录因子激活了这个转录本。
我给出数据链接了，不死心的，还可以用“生信方法过滤”去试试看能不能纠正这个bia
PacBio做这个疾病的对比
再来更多疾病，更多基因
不具体列了哈，有一张表:

去年，千年棒子也出来背书了

下面讲一个完整的Story,是关于艾滋病与流行病学的:
1. 测序在病毒研究上面临的挑战。
2. 艾滋病毒的衣壳蛋白对于艾滋疫苗的研究至关重要：
3. 正常人在感染艾滋病毒后，有20%的人群会产生免疫抗体，但是与此同时，病毒也不断地在人体内产生突变，以此逃逸免疫系统的猎杀，最后的结果，往往是人体免疫速度更不上病毒进化速率，终于在整场战役中被拖垮。
4. 该项研究的实验方案，一周内从血样到测序结果，然后连续追踪同一个感染者三年，以此来研究HIV是如何在体内进化的。
5. 分析工具
6. 整个实验周期内，发现的病毒株系谱
7. 不同突变位点在整个株系中随时间的演变，记录着免疫系统与之可歌可泣的战斗历程

最后，要借用某蒲的名言：“科研上只有第一，没有第二”。而在应用上，跟随者只能被领跑者套上专利的紧箍咒。Illumina目前的优势在于成本，科研上老实讲，有点奥特了。从Broad Insitute 2012年种下的种子，现在已经开花结果了。