pcr

上周开题老板没在，昨天科会后专门听了我的开题报告，基本上没有对课题设计给出太多意见和建议，不过还是催促快点发文章。 1． 4* 和 5* 的风险似乎没有太多的结果，总让人觉得悬悬的，师兄也建议放放了，主要是 PAGE 的结果不确定， PCR 的条件似乎也不稳定，测序杂合也不好说。我应该自己抽空再优化一下条件； 2． 现在的全长细胞单克隆是最烦人了，而且始终鉴定不出来，这个最头疼！ western 是赶紧得出结果的东西，不然细胞总鉴定不了，这么养着也不是个办法； 3． 和孙立军同时合作的 cyclin 家族的 RT-PCR 希望合作愉快，除了 RT-PCR 之后也是要做 Western 的，才能获得指标； 4． 主任指示的将构建的载体做原核表达做单抗的工作，也要尽快完成，原核表达的那一套东西早上刚看过资料，基本上应该跟真核表达差不多吧，不过很久没有做分子克隆的东西了，现在连瓶皿之类都要重新准备，更别说感受态细胞等，不过做起来如果顺利的话也很快； 5． 剩余的缺失突变体应该将 5* 的一套转染细胞，这样又是一个月的时间，提质粒、筛选，这个主要是在前期组化表达的基础上，加一些指标，跟我的 4* 、 5* 全长一起，从比较确定的 apoptosis 上得到指标，发文章，当然此后的工作会更多。 6． 如此说来，我现在的事情好多哦，分子克隆的、养细胞、转细胞、 western 、 RT-PCR

生物的东西必须要主动去了解，否则视野容易受到限制，尤其是分子生物学的核心技术。 The Complete Guide to PCR (How it Works, Primer Design, and Running Reactions) 目的：从DNA双链中扩增出感兴趣的区段，用于后续的研究。 原理：DNA结构，双螺旋，AT、GC配对；DNA双链在临界温度会解链，退火后又会恢复；引物，DNA复制的起点，之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已有的DNA链上。 操作核心： wiki上很全面 1. 引物设计，会考虑GC含量，决定退火温度； 2. 变性、退火和延伸； PCR Applications―Top Seven Categories Gene expression Genotyping (detection) Cloning Mutagenesis Methylation analysis Sequencing Medical, forensic, and applied sciences 问题： 1.真核生物的组蛋白会影响PCR吗？ 2.为什么需要前后引物，前后引物是如何p出指定区段的？ 逆转录PCR，就是PCR的一个常规应用，我也跑过，见过庞大的机器，也是先设计引物，然后提cDNA，定量。 一条RNA链被逆转录成为互补DNA